Был вторым из одиннадцати детей, рождённых в семье квакера Самуэля Хопкинса (1759—1814) из Крофтона, штат Мэриленд, и Ханны Дженни (1774—1864). Семейство занималось выращиванием табака. 12-летний Джонс был обязан работать на семейном предприятии, что мешало его учёбе. С 1806 по 1809 год он, вероятно, посещал местную бесплатную школу.

В 1807 году Хопкинсы освободили своих рабов в соответствии с тогдашними представлениями в обществе и сделали их труд свободным.

В 1812 году Хопкинс покинул плантацию родителей и перешёл на работу к своему дяде Жерару Хопкинсу, занимавшемуся оптовой торговлей в Балтиморе. Живя с семьёй своего дяди, Джонс влюбился в двоюродную сестру Элизабет, однако, табу квакеров на браки двоюродных родственников не позволили им заключить брак. Ни Джонс, ни Элизабет впоследствии не создали семьи.

Первые успехи в бизнесе пришли к Хопкинсу в 1812 году, когда дядя поставил его во главе магазина (1812). Через семь лет работы с дядей Хопкинс ушёл к Бенджамину Муру, тоже квакеру. Это деловое партнерство впоследствии также прекратилось, по мнению Мура причиной явилась склонность Хопкинса к накоплению капитала.

В 1819 году Хопкинс вместе с тремя своими братьями организовал торговое предприятие «Хопкинс и братья», торговавшее в долине Шенандоа из фургонов.

Большую часть своего состояния Хопкинс сумел собрать в результате разумных инвестиций во множество предприятий, в первую очередь, в железные дороги Балтимора и Огайо, где он занимал руководящие посты с 1847 года, с 1855 года он — председатель Финансового комитета. Был также президентом Купеческого банка, директором ряда других организаций. В 1847 году Хопкинс смог выйти на пенсию. В 1857 и 1873 году используя собственные средства Хопкинс выводил железную дорогу из долгов.

По завещанию Джонса Хопкинса был основан Госпиталь Джонса Хопкинса. По мысли Хопкинса, это учреждение должно было сочетать в себе лечение пациентов с преподаванием лечебного дела студентам и проведением научных исследований. Первоначальные планы устройства больницы были разработаны хирургом Джоном Шоу Биллингсом. Архитектурный проект выполнен Джоном Рудольфом Нирнзее и завершён Эдвардом Кларком Каботом из Бостонской фирмы Кабот и Чендлер. Открытие состоялось 7 мая 1889 года.